考马斯亮蓝测定固体物质蛋白质含量
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解决时间 2021-01-14 00:20
- 提问者网友：眉目添风霜
- 2021-01-13 15:08
考马斯亮蓝测定固体物质蛋白质含量
最佳答案
- 五星知识达人网友：野味小生
- 2019-06-26 09:10
实验十四 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一、 目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、 材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
新鲜绿豆芽
2．主要仪器
（1）分析天平、台式天平
（2）刻度吸管
（3）具塞试管、试管架
（4）研钵
（5）离心机、离心管
（6）烧杯、量筒
（7）微量取样器
（8）分光光度计
3．试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇
（4）磷酸（85％）
四、操作步骤
1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管 号
1
2
3
4
5
6
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
蒸馏水（mL）
1.00
0.98
0.96
0.94
0.92
0.90
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（μg）
0
20
40
60
80
100
OD595nm
（2）0~1 000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
管 号
7
8
9
10
11
12
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.00
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（μg）
0
200
400
600
800
1 000
OD595nm
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。
表3 待测液蛋白质浓度测定
管 号
13
14
蛋白质待测样品提取液（mL）
0.1
0.9
5
0.1
0.9
5
蒸馏水（mL）
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
OD595nm
蛋白质含量（μg）
五、结果计算
X×
提取液总体积（mL）
样品蛋白质含量（μg / g鲜重）=
测定时取样体积（mL）
样品鲜重（g）
式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
六、附 注
1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。
七、思考题
1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？
参考答案
1．将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。
一、 目的
学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、 材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
新鲜绿豆芽
2．主要仪器
（1）分析天平、台式天平
（2）刻度吸管
（3）具塞试管、试管架
（4）研钵
（5）离心机、离心管
（6）烧杯、量筒
（7）微量取样器
（8）分光光度计
3．试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇
（4）磷酸（85％）
四、操作步骤
1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作
管 号
1
2
3
4
5
6
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
蒸馏水（mL）
1.00
0.98
0.96
0.94
0.92
0.90
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（μg）
0
20
40
60
80
100
OD595nm
（2）0~1 000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作
管 号
7
8
9
10
11
12
1 000μg／mL标准蛋白液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
1.00
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（μg）
0
200
400
600
800
1 000
OD595nm
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。
表3 待测液蛋白质浓度测定
管 号
13
14
蛋白质待测样品提取液（mL）
0.1
0.9
5
0.1
0.9
5
蒸馏水（mL）
考马斯亮蓝G-250试剂（mL）
OD595nm
蛋白质含量（μg）
五、结果计算
X×
提取液总体积（mL）
样品蛋白质含量（μg / g鲜重）=
测定时取样体积（mL）
样品鲜重（g）
式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
六、附 注
1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。
七、思考题
1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？
参考答案
1．将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。
全部回答
- 1楼网友：底特律间谍
- 2020-01-20 05:01
首先所有使用玻璃器皿都要洗干净。1、考马斯亮蓝应在乙醇、磷酸介质中尽量溶解充分。然后过滤定容摇匀。2、用固定的2个比色杯做标准空白比色杯固定，每次测完后用乙醇将测定a值的比色杯洗干净。我测定的r值在0.9925到0.9986供你参考
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