WGBS测序深度和生物学重复知多少

WGBS测序深度和生物学重复知多少

转录水平的研究中设置多少生物学重复和测序深度比较合适？
生物学重复可以定义为使用来自不同抽提的样本进行实验，例如，上图中同一来源独立制备的3只老鼠。对每一个样本制备来说，只要抽提之后的步骤是独立进行的，那么分析测量就是独立的。虽然对于特定的基因，生物学重复的变异大于技术重复，但是由每一个独立样本引入的偏差通过取每一个测量的平均值几乎消除，因此生物学重复的实验结果易于广泛概括。通常，生物学重复用于概括性结论的验证，技术重复用于减少这些结论的变异性。这也是为啥高分文章需要更多生物学重复。具体两个例子说明下设置生物学重复的重要性：

案例1：Sequencingtechnology does not eliminate biological variability.

图说明：A plot of the expression for two genes COX4NB (left column, pink)and RASGRP1 (right column, blue) as measured with sequencing (top row) andmicroarrays (bottom row) versus biological sample. Mean-centered measurementsfrom the two studies are plotted as circles and triangles, respectively.

从图上看，测序和技术的结果一致性很好（其实测序和芯片技术各有优劣势，以后有机会再说）。COX4NB在生物学重复样本中表达差异非常小；但在同样情况下，RASGRP1的生物学差异很大。这结果意味着：不同实验组间COX4NB的表达水平的变化存在研究意义；而同样情况下RASGRP1的检测数据可能不能说明问题。通俗点说，如果癌和癌旁的差异表达是“COX4NB”基因表达形式，那么很容易重复做出结果，而如果三对三筛选出“RASGRP1”的基因表达形式，那么你扩大样本验证就会出现和前期筛选不一致的结果。

案例2：GEO数据库下载两组数据的分析
下图是两组数据，癌（黄线左侧）和正常组织（黄线右侧）筛选的部分差异基因。如果选择3个重复如上方箭头标出的，这个基因就没有差异。如果选择4个重复如下方箭头标出的，这个基因就出现相反的变化水平。
作图软件源自微信公众号《实验万事屋》介绍的GENE-E

说了这么多，大家都知道实验设计中重复越多越好，但是具体多少比较合适，下面几篇文献供参考：

文献A. Howmany biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and whichdifferential expression tool should you use?

数据来源：RNA was sequenced from 48 biological replicate samples ofSaccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）in eachof two well-studied experimental conditions; wild-type (WT) and a Δsnf2mutant. Quality control and data processing steps rejectseveral replicates from each condition resulting in 42 WT and 44 Δsnf2biological replicates of “clean” data totaling ∼889M aligned reads.

这篇文章主要提出了2个问题：
1. 在RNA-Seq实验中需要多少生物学重复提高差异基因鉴定工作的准确性和灵敏度？
参考答案是：至少6个重复以上，12个以上更佳。至于你纠结6个重复怎么来的，请看下图:

2. 在一定重复数量的RNA-Seq中，用哪种统计算法或工具更合适？
参考答案是：.如果每组少于12个重复，相对的edgeR更优秀一些，如果超过12个重复，DESeq更佳。文章使用的统计算法如下表：

另外值得一提的是，这篇文章中的模式生物是酿酒酵母。我“百度”（别鄙视，没办法用google）了下，酿酒酵母菌属于酵母菌科，是一种单细胞生物，成卵圆形或球型，繁殖方式为出芽繁殖，孢子繁殖，接合繁殖三种，形态简单但生理复杂，工业上用于酿酒。它的参考基因组如下:

至于你问我其他物种多少生物学重复合适，我只能说越多越好了。

文献B.Differential expression in RNA-seq: A matter of depth