如何提高iPS细胞的制备效率

如何提高iPS细胞的制备效率

经过了漫长又短暂的发展，iPS细胞技术已经取得了举世瞩目的进展。一个个突破性的成果既给我们带来了喜悦，也带来了新的挑战，细胞重编程有望迎来一个新的研究浪潮。尽管iPS细胞有着诱人的应用前景，然而，未来iPS细胞的研究也面临着许多亟需解决的问题，首要就是制备效率。

1. 基因的阻断
自从iPS细胞发现以来，科学家们已经通过导入转录因子成功地将多种体细胞诱导为iPS细胞，但诱导效率很低一直是iPS技术的主要障碍。转录因子c-Myc是一种原癌基因，人们试图将这一基因去除以降低致癌性，然而，c-Myc去除后致癌性虽然降低了，诱导效率却更低了。2009年9月，Hong等H
J发现，去除c-Myc基因后用siRNA
阻断一个名为p53的基因，可以将皮肤细胞转化为iPS细胞的成功率提高至10％左右，大约是原有转化率的百倍。研究证明，p53是调控细胞程序重排的关键因子，它关系到转化效率的高低。DNA芯片的分析结果发现，在小鼠和人的成纤维细胞中有34个与p53调节有关的基因，对这些基因的功能分析表明，阻断p53—p21通路不仅提高了iPS细胞的转化效率，也降低了iPS
的致癌性。更为重要的是，沉默p53基因不仅可用于病毒载体诱导技术，而且对质粒或是蛋白诱导转化的技术也同样可行。

2. 协同作用
北京大学邓宏魁教授在诱导人iPS细胞时，筛选了一系列的相关基因，发现p53基因的干涉小RNA和基因的导入可以协同作用，将iPS细胞的诱导效率提高近100倍，即使不用原癌基因c-Myc，也能高效、稳定地诱导人iPS细胞的形成。

3. 脂肪干细胞的诱导
斯坦福大学研究人员Sun等l5州发现，与皮肤成纤维细胞相比，脂肪干细胞(Humanadipose stem
cells，hASCs)更容易被诱导为iPS细胞，且产生的iPS细胞安全性更高。他们发现，在脂肪干细胞和皮肤成纤维细胞中分别加人能够编码4种转录因子的基因后，约有万分之一的皮肤成纤维细胞转变为iPS细胞，而转变为iPS细胞的脂肪干细胞比例达到2％。，是前者的20倍。诱导iPS细胞涉及的4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c—Myc)在皮肤成纤维细胞中基本不表达或表达水平很低。脂肪干细胞内两种转录因子的表达水平高于皮肤成纤维细胞，这表明，在初始状态下，脂肪干细胞更容易被诱导。利用脂肪干细胞诱导的iPS细胞能够分化成人体内的神经细胞、肌肉细胞以及肠上皮细胞等。此外，利用脂肪干细胞培养iPS细胞不需要饲养细胞，这无疑提高了其安全性。因hASCs为iPS细胞提供了更好的体细胞来源，将来当iPS细胞应用于临床治疗时，可选择适当的供体细胞种类，既保证了较高的诱导效率也提高iPS细胞的安全性。

4. iPS细胞诱导的氧环境
培养环境的氧浓度对iPS细胞的诱导效率也有影响。Yamanaka等人发现机体内的干细胞总是集中于氧气相对少的地方，于是，他们在利用人体皮肤细胞培养iPS细胞时把培养环境的氧浓度从通常的21％降到5％，发现iPS细胞的生成效率可提高到原来的2．5倍至4．2倍。但如果进一步降低氧浓度到1％，就会适得其反导致部分细胞死亡。诱导鼠的皮肤细胞时同样也验证了5％的氧浓度是最合适的。因此，他们认为，通过降低培养环境的氧浓度，并且使用细胞癌变可能性较小的培养方法，就可高效地获取更高品质的iPS细胞。2009年10月，美国斯克里普斯研究所丁盛博士领导的研究小组

将焦点集中在了可生成结缔组织的成纤维细胞生成的自然过程一间质一上皮细胞转化的研究上，他们发现两种化学物质的组合，在促进成纤维细胞转化成干细胞方面的效用最高，比传统方法的效率高100倍。随后，研究人员又锁定了一种名为Thiazovivi的新型化合物，可提高效率200倍，同时将转化周期由原来的4周缩短到2周
。

5. 添加物的作用
2009年12月，中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿带领的研究小组另辟蹊径，将研究方向放到细胞外环境一培养基成分上，通过在培养过程中添加维生素C可使iPS诱导效率提高10倍，并通过老鼠和人细胞实验发现，培养时添加维生素C可促进相关基因表达推动体细胞进入重编程状态。他们用缜密的实验设计证明了外因在iPS中具有重要作用。此外，美国哈佛大学研究人员还发现，添加特殊的化合物可将体细胞诱导iPS的效率提高100多倍

。在诱导过程中，他们使用了4种遗传基因，同时加入了7种包括可阻碍特定蛋白质合成的化合物，结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入效率为0．01％～0.05％，而加入了一种叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻碍剂之后，导人效率竞升至9．6％～14％。同时，最新的报道也发现，丁酸盐处理可以显著提高人iPS诱导效率。