为什么在提取蛋白时的最后通常要灭酶

为什么在提取蛋白时的最后通常要灭酶

通常，高温、有机溶剂都能使蛋白发生不可逆的变性失活，可是为什么对RNA酶不起作用？导致提取RNA时总是异常小心谨慎，很麻烦求解啊！80年代初，美国Colorado大学化学与生物化学系T.R.Cech教授（1989年诺贝尔化学奖获得者）及其合作者们发现从原生动物四膜虫中提取出的RNA能自发地催化其切割与剪接过程，从而导致自身长度的缩短。这种RNA的形成需要从其前体中准确地切去含有413个核苷酸的插入片段（IS）并进行一系列切割、剪接（图2、3）。在研究中，Cech等惊讶地发现，该片段的切割、剪接并不需要酶——至少不需要传统意义上的酶——只需要适量三磷酸鸟苷（GTP），或者正如后来所发现的，只需要适量鸟嘌呤或其衍生物。核酸所进行的是一系列快速、温和的化学反应，从而导致不需要蛋白质酶的辅助而完成自身的切割、剪接。它与蛋白质酶的唯一不同在于：酶是作用于其他分子，而这种RNA是作用于自身。基于该点考虑，T.R.Cech将这种RNA定义为Ribozyme，即RNA酶（或RNA催化剂）。然而，近年的研究发现，许多RNA却能催化其他分子而不是本身，从此，Ribozyme就完全符合酶的定义了。 自从第一个Ribozyme被发现并命名后，至今已发现了几十种Ribozyme。现已发现的Ribozyme按其作用方式可分为切割型和剪接型。切割型的Ribozyme是只切不接，而剪接型的却既剪又接。无论是切割还是剪接，所有的切割-连接反应都是转酯基作用，即酯交换过程。 根据作用的底物分类，Ribozyme可分为自体催化和异体催化两类。绝大多数Ribozyme以自身为底物，进行自体催化，即自我切割或自我剪接。而异体催化则是以其他分子为底物，可以是不同的RNA，也可以是其他分子。各类Ribozyme通常以RNA为底物，但也有例外。与蛋白质酶相比，Ribozyme的催化效率较低。如四膜虫rRNA插入序列具有核糖核酸酶的作用，水解RNA的速率为30秒钟一次，而胰RNA酶作用速率则为每秒钟数千次。另外，RNaseP中RNA单独作用时，催化效率很低，而结合蛋白质后，其催化效率大为提高，这也许与蛋白质上含有多种活泼基团有关。 正如蛋白质酶的专一催化性能是由其特定的氨基酸序列及由此而决定的特定空间位置所决定的，不同Ribozyme也具有不同的碱基序列，因而也具有不同的，但是对每个Ribozyme来说是特定的三维空间构型。不同的空间构型决定了不同的磷原子与自由羟基之间空间位置的不同，从而导致了羟基对磷原子的不同的、但对每个Ribozyme来说却是特定专一的进攻，即在特定位置进行切割、剪接。亦即不同的Ribozyme具有不同的切割、剪接方式，而对每一个特定的Ribozyme却又是特定专一的，这就是Ribozyme的多样性和专一性。 然而，可以估计，Ribozyme的催化多样性远不如蛋白质酶。这是因为蛋白质酶的组成远 近来的研究还发现，Mg2+的存在对Ribozyme的催化能力有所影响：一般地，Mg2+能加快催化反应，对于有些Rihozyme来说，缺少了Mg2+就起不到催化作用，从这个角度来看，Mg2+对于某些Ribozyme可称为是一种辅酶。Mg2+的存在可以中和磷酯基团上的负电荷，使之易受亲核试剂的进攻。同时Mg2+较易与一些具有络合能力的基团络合，或许正是由于Mg2+与Ribozyme上某些基团的络合导致了Ribozyme结构的改变。 纵上所述：RNA酶在没有蛋白子辅助下，还是有活性的，只不过低而已。以上是我从RNA酶本身来的。我们也可以从已知的RNA酶抑制剂来说明这个问题：1。TRIZOL，TRIZOL的组成是酚和异硫氰酸胍，酚是有强烈的蛋白变性作用，起到蛋白变性，是使RNA酶失活的主要物质，而异硫氰酸胍在这里主要起到细胞裂解的作用。2。DEPC水，DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应从而起到抑制酶活性的作用。3。在分子克隆书上有提到蛋白酶也可以使RNA酶失活。我想也是起到变性蛋白质。那从以上的三点可以知道，通常所说的RNA酶是RNA和蛋白，还应该有一些金属离子的组合体，那只要能使这些基团失活或变性，就能使RNA酶失活或暂时失活。所以楼主的提到的高温，有机溶剂，等，我认为高温（通常180度），有机溶剂（强性蛋白变性剂如苯酚）都能使RNA酶失活。乙醇不是强性蛋白变性剂，显然不能使RNA酶失活!

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。