如何设计特异性荧光原位杂交探针

如何设计特异性荧光原位杂交探针

1.探针分为好多种，你要先决定你用何种，是RNA探针还是DNA探针，杂交时，RNA－RNA结合的稳定性要比DNA－RNA好，所以RNA探针具有结合牢固、背景低等优点；DNA探针背景稍微深一些，不过也可以，标记方法比前者简单一些，另外还有寡核苷酸探针，此类探针分子量小，通透性好，但就是标记的敏感性不高。
2.原位杂交相比免疫组化，定位相对准确，但如果蛋白在间质中发挥作用，原位杂交就检测不出来了，结合图像分析，原位杂交也可以对目的基因的转录半定量。
3.首先是标本对照，这个包括阳性对照和阴性对照；第二个是探针对照，主要是明确探针的特异性；第三个是探针正义连阴性对照，第四个未标记探针竞争抑制；第五个不含探针的阴性对照；第六个质粒对照，第七个无关探针对照。
4.若要定量，该试验不可行，还是作Northern，若要显示形态、定位，最好结合免疫组化。

这个问题问到点子上了，呵呵 比如： 1.浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。 2.将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和dextran sulphate。 3.杂交的温度和时间杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节，大约在30～60℃之间，根据探针的种类不同，温度略有差异，杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。 4.杂交严格度（hybridization stringency）杂交条件的严格度（stringency）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。 5.洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。