【转】如何设计用于蛋白表达的引物设计自我总结

【转】如何设计用于蛋白表达的引物设计自我总结

初涉基因工程领域，对基因操作一窍不通，连PCR都没做过，只知道有一个蛋白，已知它的序列，要在体外把它表达出来，这就是我的任务。首先是引物设计，众所周知的三大引物设计软件，oligo、primer、lasergene（DNAstar），到底用哪一个呢？这里简单说一下这三大设计软件的特点：Oligo：对引物的分析功能十分强大，包括引物发卡结构，引物二聚体，Tm值和非特异性结合等等都能进行全面的的分析，并能生成详细的报告。毫无疑问，oligo的分析功能是最强大的，可惜的是它的自动搜索能力是三者中最弱的。Primer premier：具有强大的搜索功能，能按照不同的要求设计引物，并给引物打分，但是它对引物的分析功能远比不上oligo强大和全面。非常适合初学者。Lasegene：结合上述两者的优点，但搜索和分析功能都属于中规中矩。笔者在使用过程中发现一个严重的缺点，lasegene不能对引物进行编辑和修改，在这一点上Primer premier就做得好多了。软件各有所长，使用哪个软件完全取决于自己的习惯和爱好。但不论使用哪个引物设计软件，笔者认为，理解引物设计的基本原理是必要的。调阅读框不是调你目的基因的ATG，而是调你目的基因正确翻译的第一个密码子和表达载体的N端Tag的起始密码子ATG之间的碱基数要保持在3n。设计用于表达的引物，主要流程基本如下：1、选切点：按照MCS中的切点来选2、调阅读框：主要是调N端和C端两个方向，由于一般载体都有N端的Tag，整个载体的翻译是从N端Tag的起始密码子ATG开始（ATG并不等于起始密码子,一定要注意只有RBS后第一个ATG才是起始密码子），你可以模拟你的片段已经通过酶切连到载体上，然后计算N端Tag的起始密码子到你的目的基因的第一个密码子（这里不一定是ATG，很多情况是部分表达或截断表达，这里顺带解决部分人的疑问，部分表达不用特别在目的片段前加一个ATG）之间的碱基数为3n，若为3n+1，你要在forward primer的5‘端，但要在酶切位点后随机加2个碱基，若3n+2，则加一个，捎带注意一下，加上去以后不要形成TAA、TAG和TGA。