请问免疫放射法检测胰岛素的具体实验步骤

请问免疫放射法检测胰岛素的具体实验步骤

分别在一定数量的试管中加入不同浓度的标准抗原（或未知样品），每管加入等量的放射性标记抗原和一定量的抗体，在4℃或37℃下保温,待反应平衡后,选用适当的方法将B和F分离，测量放射性强度,由放射性强度比B/T对Ag量制出标准曲线,即可从标准曲线上查出未知样品量。
测定时，首先要制备出纯的抗原和抗体。凡能刺激机体产生抗体，且与抗体发生特异性结合反应的物质通称为抗原，例如蛋白质(细菌、病毒、异种血清等)。只有反应原性而无免疫原性的物质称为不完全抗原或半抗原，如多糖、类脂和一些小分子物质。可用化学方法把一些半抗原与载体（蛋白质的大分子）结合而获得免疫原性,这种结合为RIA 开辟了广泛的应用范围。常用的载体有γ球蛋白、纤维蛋白质、鸡卵蛋白、血蓝蛋白和各种甲状腺球蛋白。半抗原结合载体是由半抗原的功能基团与载体功能基团所决定，一般连接后不应引起半抗原结构改变，也不使载体蛋白变性。常用结合载体的方法有混合酸碱法、水溶性的羰二亚胺法等。
抗体是能与相应抗原或半抗原专一地结合的免疫球蛋白分子。应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范围由其特异性和亲和力决定，测定时所用的抗体稀释度越低，则加入的量越多，测定的敏感度越低，可测范围越宽。如加入抗体量少，则测定的敏感度提高，可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后，即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量。
常用于标记抗原的放射性同位素有3H、125I、131I 等，3H可以置换有机化合物中的氢，且不影响原有化学性质。3H半衰期长，能量低，便于防护，常用的标记化合物有3H环磷酸鸟苷、3H环磷酸腺苷、3H睾丸酮等。125I 和131I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。有些半抗原不能直接用碘标记, 常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。常用的偶联试剂有：碳化二亚胺类、异?唑盐类、烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。