要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法

要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法

对角线电泳是一种经典的二硫键定位分析方法.

这种技术包括：
（1）胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质；
（2）在酸性pH＝6．5的条件下进行第一向电泳,酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离；
（3）将滤纸暴露在过甲酸（CHOOOH）蒸气中,使二硫键氧化断裂,并进一步氧　化成磺酸基,被氧化的半胱氨酸称为磺基　丙氨酸；
（4）将滤纸旋转90.角,在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳.无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等,将位于一条对角线上.那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同,将偏离对角线.肽斑可通过茚三酮显色来确定.将含磺基丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推断二硫键的位置.如果蛋白质中存在其他未成二硫键的半胱氨酸,要先用碘乙酰胺封闭其一SH后再酶解.此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化,这样可能会增加分析的复杂性.

对角线电泳是一种经典的二硫键定位分析方法。这种技术包括：（1）胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质；（2）在酸性ph＝6．5的条件下进行第一向电泳，酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离；（3）将滤纸暴露在过甲酸（choooh）蒸气中，使二硫键氧化断裂，并进一步氧　化成磺酸基，被氧化的半胱氨酸称为磺基　丙氨酸；（4）将滤纸旋转90。角，在与第一向完全相同　的条件下进行第二向电泳。无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等，将位于一条对角线上。那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化，肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同，将偏离对角线。肽斑可通过茚三酮显色来确定。将含　磺基丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推断二硫键的位置。如果蛋白质中存在其他未成二　硫键的半胱氨酸，要先用碘乙酰胺封闭其一sh后再酶解。此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化，这样可能会增加分析的复杂性。