pcr引物一个gc含量太低怎么办

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解决时间 2021-02-08 02:16

提问者网友：放下
2021-02-07 20:42

pcr引物一个gc含量太低怎么办

最佳答案

五星知识达人网友：山有枢
2021-02-07 20:58

！！gyesang(站内联系ta)你pcr的模板是什么？你做pcr的目的是什么？设计引物的时候，上下游引物的gc含量相差尽量不要太大，你接下来可以试下touchdown。意孤城_(站内联系ta)如果不想麻烦就touchdown pcr，如果求稳当设置梯度pcr，温度上下限时你两条引物的温度cicelyzh(站内联系ta)一般gc含量低的话把引物序列设计稍微长一点，就可以补偿tm低的问题。你说的百分比差别也不是那么大。如果两个引物的tm不同，按照低的考虑pcr的退火温度。加酶切位点的引物的tm需要按照不包含酶切位点的序列计算。xikexiao(站内联系ta)gc含量最好在50%以上比较好，不然退火温度达不到，建议重新设计引物scilencing(站内联系ta)试试梯度pcr的策略

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1楼网友：底特律间谍
2021-02-07 21:32

我给你理一下思路哈~ 首先,你用设计的引物做第一轮pcr的时候,产物扩出来了. 该产物是否测序?或者你只是用marker估算了一下. 然后,你把该pcr产物进行下一轮扩增,没有条带： 1.第二轮pcr的问题： a你加的pcr模板会不会太多,只要不是几十几百ng,问题还是不大的 b你第二轮设计的引物有没有问题? 2.第一轮pcr的问题： a你第一轮设计的引物有没有问题,会不会出现非特异性扩增? b第一轮到第二轮之间有没有什么操作影响了扩增（有的话,再分析这个） 3.整个pcr的问题： a你要扩增的片段是否有问题?是否GC含量过高等 b确认试剂和酶

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