请教：提取RNA 和反转录的操作注意事项
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解决时间 2021-11-16 16:46
- 提问者网友：你给我的爱
- 2021-11-15 22:54
请教：提取RNA 和反转录的操作注意事项
最佳答案
- 五星知识达人网友：刀戟声无边
- 2021-11-15 23:47
你按照买的反转录试剂盒来做就行.
（1）、从细胞中提取细胞总RNA
用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA.按试剂使用说明操作:离心收集细胞,倾去细胞液,向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞),混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打,直至细胞完全裂解成均一溶液,不粘稠时为止.随后加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒钟,室温放置5分钟,然后,4 0C ,12000rpm离心5分钟,将上层水相转移至一Eppendorf管中,加入500ul异丙醇后混匀.4 0C , 1 5000rpm离心15分钟,倾出异丙醇.用70%乙醇洗涤沉淀一次,置冰上,让残余乙醇挥发殆尽.溶于适量的DEPC水中,紫外分光仪测定RNA的纯度及含量,分装冻存于一700C保存.
（2）、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)
在20ul体系中,加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水,70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却,继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种),混匀后于42℃保温2分钟,加入1ul( 200U)的反转录酶,42℃继续温育50分钟.700C 15分钟灭活反转录酶.
（3）、 引物设计
(4)过程: 以1ulcDNA为模板,在50ul体系中含有Taq酶为2单位,dNTPs浓度为200uM,引物各为0.2uM.扩增22个循环.取8ul电泳.
（1）、从细胞中提取细胞总RNA
用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA.按试剂使用说明操作:离心收集细胞,倾去细胞液,向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞),混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打,直至细胞完全裂解成均一溶液,不粘稠时为止.随后加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒钟,室温放置5分钟,然后,4 0C ,12000rpm离心5分钟,将上层水相转移至一Eppendorf管中,加入500ul异丙醇后混匀.4 0C , 1 5000rpm离心15分钟,倾出异丙醇.用70%乙醇洗涤沉淀一次,置冰上,让残余乙醇挥发殆尽.溶于适量的DEPC水中,紫外分光仪测定RNA的纯度及含量,分装冻存于一700C保存.
（2）、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)
在20ul体系中,加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水,70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却,继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种),混匀后于42℃保温2分钟,加入1ul( 200U)的反转录酶,42℃继续温育50分钟.700C 15分钟灭活反转录酶.
（3）、 引物设计
(4)过程: 以1ulcDNA为模板,在50ul体系中含有Taq酶为2单位,dNTPs浓度为200uM,引物各为0.2uM.扩增22个循环.取8ul电泳.
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