显微注射的操作方法

显微注射的操作方法

以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头(GlassNeedle，精细的玻璃微量毛细移液管)的使用，已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法，比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为---显微操作，因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置（显微操作器）以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。

直接把重组过的 DNA 注入受精卵的原核(pronuleus) 中，也就是将从胚胎提供者的输卵管中取得的受精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，将 DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。