求助柠檬酸合成酶活性测定方法

求助柠檬酸合成酶活性测定方法

一般机器都是检测一定波长下面的吸光读Absorbence（A），或者光密度Optical Density（OD），
Amin-A0：即第min时间的吸光度减去反应开始时的吸光度（即终点法检测，使用两个数据点来计算）。
/min：即上述吸光度的差值再除以时间，也就是单位时间吸光度的改变。
由于吸光度等于，或者正比与产物的生成或者底物的减少，所以这就是单位时间内产物的生成量或者底物的减少量，也就是该反应的速率。
/mg（protein）：是指将上述反应速率除以你使用的酶量，即单位酶量能产生的反应速率，也就可以认为是一个酶的Kcat值，指标一个酶的酶活力。

当然，这个Amin以及A0必须在酶反应在线性时间内检测，超出线性范围之后就不对了。

下面是我查到的一个方法： 柠檬酸合成酶测定缓冲液配制： 样品缓冲液ph 7.5 100 tris/hcl 50 mm 0.6055 g kcl 100mm 0.7455 g edta 1mm 0.03722 g 储存液1 10ml acetyle-coa 2.5 mm 20.225 mg 储存液2 10ml oxaloacetate(oaa)5 mm 6.6035 mg 储存液3 10ml dtnb 5.025 mm 19.914 mg 步骤：520ul样品缓冲液+20uldtnb+20ul acetyle-coa+20ul待测酶液，25℃温浴5min。加入20uloaa立刻放入25℃恒温的分光光度计，在波长412nm测定3min(每30秒记录一次光密度)光密度变化值。在25℃作双份测定，取其均值为测定值，酶活力单位用u/min/g表示，其 计算：u/min/g＝(amin-a0)/min/mg（protein）。 这个计算公式读得不太明白。 该方法来自《缺氧及缺氧复合运动大鼠心肌_骨骼肌的适应性变化及机制》（博士论文，2005年，第三军医大学）