我是荧光定量pcr初学者，现在想做定量试验，最近做了个标准曲线，可是内参和目的基因的点都不在线上。

我是荧光定量pcr初学者，现在想做定量试验，最近做了个标准曲线，可是内参和目的基因的点都不在线上。

可以78℃读板，这样Ct值就只是产物的值了，另外你的NTC可能是污染了，稀释的过程中也要防止污染，尤其是标准品，追问NTC我也不知道为什么会这样一直有峰，且tm值跟产物的是一样的，就是图片上的那两条溶解曲线，分别是两个基因的NTC。我是还没加模板的，只加了引物和mix。我都不知道是什么东西污染了，水应该是没事的，我水有做空白可都没事。追答1. 不知道你做的是什么样品，如果是细菌，空气中可能会有污染；
2. 可能是体系污染，所有的体系全部换新的，引物重新稀释；在这之前可以只做一下NTC，不带样品孔，试试，
3. 但是你说水做空白就没事，是什么意思，是指只有水还是说以水为模板，
对于发卡结构不是很了解，追问我是做真菌的，我也试过了用这个基因的另外两管新的引物，可是不知道为什么还是会这样。我用另外一个基因的引物做出来也是没事，都不会出现这种情况，水我是用来做空白对照的。嗨，对于这个问题我真不知道该怎么办了。标准曲线好像真的很不好做，引物是我自己设计的，不知道是不是引物不好的原因。追答看起来好混乱，可以用Q么
1. 是一个孔里只加水么。
2. 为什么要内参，不是标准品的标准曲线么

qPCR手抖一下就好几倍的差别甩出去的 啥样的结果都挺正常 多做几次取个最稳定的结果就行了

从溶解曲线上看，确实有非特异性的扩增，在75度左右的小峰。样本的浓度越低，这个非特异的干扰就越大。最好不要用Sybr Green做。改用探针吧追问看溶解曲线是好像有引物二聚体的形成，如果我提高退火温度和荧光信号采集温度的话效果会不会好些？提高信号采集温度会不会影响标曲的制作？

谢谢追答信号采集温度不会有影响的。二聚体的话，提高退火温度也是于事无补