酶切问题！！这种情况怎么判断酶切成功？？

你好，最近我试验遇到了一个问题，向想你求助哈！我需要提出一个22kb左右的大质粒，进行BamHI大量酶切，但是昨天我小量酶切（10微升体系）后，发现未酶切前的质粒与酶切后的质粒跑胶后位置几乎没有差别。奇怪的是，我marker最大的一条为23000bp,未酶切的质粒竟然滞后于最大的这条带，酶切后的质粒稍稍比没酶切的质粒跑得快一点点（几乎不可分辨），我现在无法确定是否酶切开了~~很着急~~请高手帮助！！还有，为什么没酶切的质粒会跑这么慢呢？

对于大的质粒，用电泳速度去判断基本很难，除非去做脉冲电泳。你看看MARKER的条带和速度就知道了，在100、200时，电泳一会儿就分得很开，而8K、10K想分开就要，要的时间比较长，而象DL15000，后面的条带是10K和15K，就算这样还只能会开一点点。
并且核酸电泳速度还与本身浓度，盐离子浓度有关，所以大片段普通电泳基本没法判断大小。如果你有λDNA，可以一起跑着试一下，那个更大，但电泳速度与你的23K也不会差太多。
如果只是单纯的判断是否酶切开了，可以做一下转化。
用切过的和没切过的一起去转化感受态。看看他们长出多少斑来。理论上，如果酶切完全，不应该长出斑来的。

环状质粒的拓扑结构并不固定，一般来说环状质粒电泳速度要比线性的快，但其移动速度并不是一定的，所以有可能出现你遇到的情况。 其实，要验证酶切是否有效很简单，只需实验时再加一个对照，用BamHI和另外一个已知位点的限制性内切酶进行双酶切，电泳查看DNA条带是否和预测的条带相符即可（双酶切至少会生成两个以上的DNA条带，所以便于检验）。

你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接，而无论是pcr还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全，所以不好进行连接呀？对于pcr产物一般会采取这样的策略，将产物首先连接到t载体上，然后再用设计好的双酶切，电泳回收切下的条带，这样就能确保得到的是完全酶切的产物。载体判断比较麻烦，要看载体本身、多大双酶切为点之间的条带有多大、双切前后的大小是否能通过电泳区别出来，但是双切位点一般都在标记基因里面，所以插入片段的载体会在后期转化可以后区分开，所以也没有太大必要确定他是否完全，只要充分酶切就好了。