RNA的生物合成

RNA合成的起始

　　在E.coli中，RNA链的起始通常是在RNA聚合酶所结合的DNA区域的一端，在解开的双链部分，离-10开始处大约12或13个碱基处。第一个核苷酸通常是pppA或pppG,较少为pppC，但偶而亦可为pppU。有时转录可在好几个相邻核苷酸处起始，也就是说RNA聚合酶似乎是可屈伸的，它能覆盖和巡游解链区的一部分，设法找出一个嘌呤作为起始，而嘧啶是它的第二选择。

　　然而从细胞内分离出的RNA分子的5'端的核苷酸却不一定是起始转录的核苷酸。因为在合成后许多RNA链还要经过内切核酸酶加工，切成较小片段，而这些片段完全可以由嘧啶起始。例如，虽然某些tRNA链的起始是U，但它们从不含有末端三磷酸基团。它们是在体内由长链RNA切割而成的。实际上所有细胞均含有许多种核酸酶，实验室中在体外合成的RNA则往往不受核酸酶的作用。

σ因子的解离

　　RNA链的延伸阶段开始后，σ因子即从核心酶-DNA-新生RNA复合体上解离下来，并可再用于和新的核心酶结合，一般认为，σ因子之所以被释放出是因为此时它已不起作用了，但也可能是因为σ因子如仍然存在将会造成RNA聚合酶与启动子序列结合过紧，以致不能再沿着模板移动。所以当新生链-酶复合体与DNA模板的结合很弱，并且酶亦不再要求与特异序列的DNA结合时，链的延伸才能达到最佳状态。

　　虽然全酶与启动子的结合要比核心酶与任何DNA顺序的结合紧密得多，但对非启动子DNA的结合却可能并不如此。因此，σ因子能抑制RNA聚合酶与DNA的非特异性结合，促使酶分子沿着螺旋轻快地旅行，直到它很快找到合适的启动子序列。通过沿着DNA向着一个方向前进，全酶就可以比它在细胞内空间的三维方向中更快得多地找到启动子。

　　因为正在转录的RNA聚合酶没有σ因子，而且在正常生长条件的细胞中可能仅有半数的酶分子是有活性的，所以没有理由认为细胞中核心酶分子和σ因子的数目是相等的。然而两者的数目不会相差过大;可能细胞内总是保持有相当数量的游离σ因子，以便一旦核心酶在转录终止而释放出来时能立即重建为全酶。

DNA的解链和重复螺旋化

　　RNA聚合酶在延伸新生RNA链时继续使DNA螺旋解链，以便暴露出模板链，RNA链的生长点是大约12bp长的RNA-DNA杂交区。在RNA链离开模板时，此杂交区即复原，同时两条DNA链即又重复螺旋化。而被延伸的酶所解开的DNA链的长度约为17bp，略长于RNA-DNA杂交链，而与在启动子形成的"开放"复合体的解链区的长度相等。测定被RNA聚合酶解链的DNA的长度的方法是,在正在转录的共价闭环DNA上用拓扑异构酶使之松弛，然后加入去垢剂以除去RNA聚合酶和RNA，最后测定DNA分子的超螺旋数，在拓扑异构酶作用下每解链10.4bpDNA即可使DNA生成一圈新的负超螺旋，所以如已知有活性的酶分子的数目，即可算出每分子RNA聚合酶所解链的bp数目。

　　虽然一般说延伸复合物可保持17bpDNA于解链状态，但此数目可以有很大的改变，特别是当RNA聚合酶遇见一些特殊的DNA序列时。例如，在转录终止区，DNA链可完全重复螺旋化，而酶的RNA链则从复合体中释放出。而在质粒ColEL复制时，RNA引物的转录生成的情形则正相反，在某一特异位点处DNA的重复螺旋化被阻止，生成的转录本和模板DNA形成几百核苷酸长的RNA-DNA杂交双链。目前还不知道为什么会有这样的变化，可能新生成的转录本的特异的二级结构起很大的作用。

转录因子NusA

　　NusA蛋白质多年来被忽视。这是因为RNA聚合酶的基本活性并不需要NusA，同时NusA也不和RNA聚合酶一起被纯化。λ噬菌体的N基因编码的蛋白是一种调节因子，它的功能是在λ噬菌体生长时防止转录的终止(抗终止作用)。而NusA蛋白能和N基因编码的蛋白紧密结合，这表示NusA在RNA合成中有重要作用。NusA与RNA聚合酶核心酶相结合。这类似σ因子，但不太紧密，故在纯化时往往σ因子取代了NusA。在细胞内则当σ因子从RNA聚合酶内释出时，NusA才能与核心酶结合。然而在RNA链延伸时，NusA亦不固定地和一个RNA分子相结合，因为已发现在转录时一个NusA分子可与好几个RNA聚合酶分子相作用。所以即使活细胞内NusA分子不多(估计每个细胞只有数百个)，仍然是够用的。很可能当RNA聚合酶从DNA上释出后，σ因子又马上取代了NusA蛋白。

　　在转录过程中，NusA究竟有什么功能还不了解。遗传学实验证明它是不可缺少的蛋白质。在体外，NusA对RNA合成的速率有明显作用，对不需ρ因子的RNA合成的终止也是必需的。可能NusA和噬菌体λ的N基因编码的蛋白类似，在介导某些调节因子的作用中有重要功能。

转录终止信号

　　细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子(terminator)终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。在终止子处，RNA聚合酶停止其聚合作用，将新生RNA链释出，并离开模板DNA。在某些位点处，终止需要一种辅助蛋白质，即ρ因子，但在其他位点处，核心酶本身即可终止转录。

　　对细菌和噬菌体中的终止子，特别是不需要ρ因子的，做了许多顺序分析。不依赖ρ因子的终止子有两个特征:[1]DNA顺序有双重对称(dyad)，位于RNA3'端之前15-20核苷酸处，和[2]DNA模板链中有一串约6个A，转录为RNA3'端的U(图3-11)。双重对称的意义在于其转录本能形成发夹结构。体外实验显示，如果掺入其他碱基以阻止发夹形成时，终止即不发生。通常只要有一个核苷酸的改变破坏了规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。对终止子突变的分析亦显示DNA模板上多聚dA顺序的重要性。如将此序列中的一个碱基换掉，或除去部分序列(缺失)都可使终止子失活。

←──双重对称───→

模板5'-CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3'

(DNA)3'-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTTGTTTT-5'

转录本5'-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH3'

(RNA)

　　为什么这两个结构能引起终止呢?其解释是，发夹的茎的前半部过早地和RNA-DNA杂交双链中的后半部分退火，仅剩下多聚U序列和模板链杂交。因为这样一个由几个U和几个dA形成的RNA-DNA杂交双链是很不稳定的，于是新生RNA链将很快自DNA双链中被排除出来。

　　依赖ρ的终止子没有不依赖ρ的终止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成稳定的发夹。现在还不清楚ρ因子的作用机制，但有几种可能性:[1]ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，说明它能与新生RNA链结合，并可能应用ATP放出的能量将RNA链从酶和模板中释出。[2]ρ因子可能与RNA聚合酶结合。编码ρ因子的基因rho发生突变时产生的某些ρ蛋白质仅能在RNA聚合酶的β亚基也发生相应突变时才能有RNA合成的活性。[3]已知RNA聚合酶本身能识别DNA模板中依赖ρ的终止顺序，而ρ因子是在以后才发挥作用而释出RNA的。即使是在没有ρ时，RNA聚合酶也在依赖ρ的终止子处暂停，不过以后仍继续向前进。故有人认为，即使有一个很弱的发夹也可使RNA聚合酶停止前进。此时ρ因子即可与之结合而将聚合酶和RNA解离下来。所以ρ因子也是一种酶。