DNA测序的测序原理

DNA测序的测序原理

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通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种 (ddNTP)，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。