克隆转化不成功什么原因？

我第一次做克隆菌加多了长得很密，后面做一次不如一次，最近几次干脆不长菌，换了新买的感受态细胞还是不长。DH5α感受态细胞，培养基应该没有问题，步骤按照说明书做的，到底哪里出问题了？连接体系会不会由于反复冻融坏了，导致转化不成功？

可能导致转化失败的原因太多了。如果确认板子和感受态没有问题，一般就是ligation可能出错，建议做平行实验：ligation，control，blank
L就是你的连接转化，铺在抗性板子上，编号1；
C随便拿一个大提的高纯度质粒做对照，铺在抗性板子上，编号2；
B就是什么质粒都不加做空白，铺一个抗性、一个无抗性板子，编号3，4。

虽然麻烦了点，但是很容易发现问题的根源。#3#4可以帮你判断感受态，#2可以帮你判断转化操作是否有问题，如果#1#2都没长说明你转化操作或者菌有问题，如果#2长了#1没长说明你连接有问题。

嫌麻烦只做Ligation,Control也行。

原因很多：1.培养基的问题。用确定可以长起来得菌测试一下，可以很快知道是否有问题。 2.确认抗性是否正确。 3.最可能的问题是连接转化失败，这个问题也最难解决，涉及的小问题更多。先确认试验设计没有问题，再确认酶切是否有问题，然后再确认连接过程是否符合规定。 4.如果确认上述问题都没有，那就是另一个问题：克隆的产物对转化菌种有毒性，导致正确的克隆都死了。解决方法：换菌种试试或使用特殊培养基。