荧光定量，怎么验证引物效率

荧光定量，怎么验证引物效率

构建标准曲线
可以梯度稀释PCR产物作为标准品，最好构建质粒标准品

可以用于正式实验的引物必须满足以下条件： a 溶解曲线单峰，窄而尖，否则可能有非特异性扩增；峰的位置横坐标一般在80度以上，这个温度为pcr产物的解链温度，如果在75度附近，可能是引物二聚体，mirna染料法检测时，溶解曲线的峰的位置可能在75度附近 b 琼脂糖电泳为明亮的一条带，条带一般在100bp以上，如果设计引物时pcr产物在100bp一下，需要仔细辨认是否为引物二聚体；引物二聚体的条带一般在50bp左右，条带弥散，暗。 c 扩增曲线呈“s”形，一般情况下，s形越陡，扩增效率越高，s形越平，扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期，没有指数期的情况，这时一般扩增效率较低，建议检测一下扩增效率，用标准曲线法计算相对表达量。 d 样品ct值小于30，对于ct大于30的情况，建议重新设计一对引物，重新调试。如果几对引物的ct值都较大，可以适当放宽ct至33。但是ct值肯定不能大于35。