DNA测序为什么会失败

DNA测序为什么会失败

哪些样本不好测？ 当客户把成批的样品交给商业化的测序公司时，经常会被告知一些样本没有结果，或是测得不好，无法提供图谱。做为客户常常不清楚测序失败的原因，对于一些重要的样品只好改送另外的测序公司试试看。DNA 测序失败的原因归纳起来有三种： 一是模板的原因，模板的质量很重要，加入反应里的模板“量”并不很严格，但是模板“纯度”要求很高。这就是为什么商业测序公司通常要自已提取模板的原因。控制好模板是提高测序成功率的关键因素。对于一个经过训练，实验操作稳定的人来说，使用商品化成套试剂盒处理的DNA模板的质量会有保证。其次，DNA模板不能被污染，也就是说在挑菌落，细菌培养过程要防污染。如果菌生长的不好，提出来的模版测序效果也不好。 如果DNA模板的质量没问题，有一段区域总是测不通，那就要考虑模板本身存在“难通过”的结构了。基因组中一些高度重复序列，GC 富集序列，Poly A/T 序列 通常都是测序的“难点”，相对于质粒模板，PCR 产物的测序效果要差很多。 二是引物的原因，测序的引物除了通用引物就是PCR 的特异引物了。测不出时考虑更换新的引物或者改换另一个方向来测。（注意：即使是同一个模板，正反引物测序的效果可能相差巨大）。虽然很多时候使用PCR 扩增引物来做测序引物，但是测序对引物的特异性要求很高。如果引物与模板的非特异退火，延伸会导致“套峰”样结果。测序失败。 三是测序反应条件的原因，目前DNA测序的原理是基于“酶”促反应的Sanger 法，如果模板与引物匹配性不好，自然不会延伸出DNA 片段；如果反应条件不合适，同样没用反应结果。当商业测序公司使用一个反应条件来测所有的样本时，某些样本的失败就不足为奇了。