大豆蛋白抗氧化肽的制备的详细步骤？

1，用酶水解蛋白的详细步骤，具体怎么做？

材料与试剂
大豆分离蛋白，由郑州同创益生食品有限公司提供；碱性蛋白酶（2.4AU/g）、风味复合酶（500LAPU/g）、复合酶（1.5AU/g），由Novozyme提供；木瓜蛋白酶（60万u/g），由广西南宁杰沃生物制品有限公司提供；菠萝蛋白酶（2500GDU），由广州丰天化工有限公司提供；胃蛋白酶（1∶10000）、胰蛋白酶（250.U.F.U/mg）、亚油酸（分析纯），由Sigma提供；磷酸缓冲液（pH9.35）、FeCl2-EDTA溶液（0.05mol/L）、FeCl2溶液（0.1mol/L）、KSCN（40%）、乙醇（75%，含0.3mol/L HCl）、茚三酮显色试剂、甘氨酸溶液（含氮量5ug/ml）、1mol/LNaOH溶液、2N HCL溶液等。
1.2 仪器
紫外可见分光光度计，超声波清洗机，离心分离机，pH酸度计，凯氏定氮仪，增力电动搅拌器，电热恒温水浴锅，恒温干燥箱。
1.3 实验方法
1.3.1 氮含量测定
凯式定氮（GB/T5009.5-2003）。
1.3.2 大豆肽溶液制备
配制4%（W/V）的大豆蛋白溶液，迅速加热至80℃，经80℃水浴保温热处理10min后冷却至酶最佳水解温度，保持温度和搅拌速度不变，同时用NaOH（HCl）标准溶液调节溶液pH值至酶解最佳pH值。按比例称取蛋白酶加到大豆蛋白溶液中，开始计时，在反应过程中及时加入NaOH（HCl）标准溶液维持pH值不变，到预定的反应时间提取一定体积的溶液，然后迅速升温到85℃灭酶活10min，冷却后，以5000r/min离心分离10min，取其上清液测定水解度和抗氧化值。
1.3.3 水解度测定［4］
h=（A×10-3×10）/（14×0.1）=A/14（mmol/ml）
ho=4%×7.75=0.312 （mmol/ml）
DH（%）=h/ho=23A （1）
注：h:大豆肽溶液中-NH2的浓度（mmol/ml）
ho：蛋白质溶液肽键当量浓度（mmol/ml）
A：大豆肽溶液氮浓度（ug/ml）
1.3.4 蛋白酶水解参数的确定
影响蛋白酶水解速度和蛋白质水解度的参数主要有温度、pH值、底物浓度、酶浓度、时间。以水解度为指标，先用单因素试验确定参数的最佳值，然后用正交试验优化因素组合，从而确定蛋白酶水解参数。
1.3.5 大豆肽抗氧化值测定［5］
大豆肽抗氧化值测定参考文献［5］，并作了适当修改：
在小锥形瓶内放入10ml亚油酸储备液，300ml0.05mol/L的FeCl2-EDTA溶液，500ul大豆肽溶液，混匀在暗处50℃保存4h，然后取出1000ul，加入200u10.1mol/L的FeCl2溶液，再加入1000ul的40%KSCN溶液，混匀后取出130ul放入干试管中，再加入6ml乙醇（75%，含0.3mol/L HCl），混匀后反应5min，再测定该混合液481nm下的吸光值。以未水解的大豆蛋白反应溶液的吸光值作为空白值，它的相对抗氧化值为1。
相对抗氧化值=未水解蛋白溶液的吸光值/大豆肽溶液吸光值
2 实验结果
2.1 含氮量标准曲线
用分光光度计（580nm）测得不同浓度甘氨酸工作液的吸光值见图1。
含氮量与吸光值的回归方程为：
y=1.3342x+0.0133 （2），
回归系数为R2=0.998。
方程（2）的反函数为x=0.425y-0.0095（3），
把方程（3）中的x值代入公式（1）中的A值得
DH（%）=0.17y （4）。
2.2 蛋白酶酶解参数的确定
以水解度为指标，先用单因素试验确定参数的范围值（限于篇幅，具体数据略），然有用正交试验优化因素组合，7种蛋白酶的最佳参数组合见表1。
表1 7种蛋白酶水解参数的最佳组合
温度（℃） pH值 底物浓度（%） 酶浓度（%） 时间（min）
碱性酶 60 8.0 3 0.5 60
风味酶 50 7.0 4 6 30
复合酶 45 7.0 4 6 20
木瓜酶 55 7.5 5 3 40
菠萝酶 65 8.0 5 6 30
胃酶 37 2.5 4 2 30
胰酶 50 7.0 5 3 30

2.3 大豆肽溶液的水解度
2.3.1 大豆肽溶液的吸光度值
用分光光度计（580nm）测得不同蛋白酶水解的不同浓度大豆肽溶液的吸光度值见表2，未水解的蛋白质溶液吸光度值为0.178。
2.3.2 大豆肽溶液的水解度
把表2中的吸光度值代入公式（4）得到相应的大豆肽溶液水解度，结果见图2，其中未经蛋白酶水解的大豆蛋白溶液的水解度为3.03%。
由图2可知，7种蛋白酶水解大豆蛋白的程度随着水解时间（4h内）的延长而增大，但是水解速率开始较大，后来渐渐变的越来越小。其中碱性蛋白酶比其它6种蛋白酶的水解能力明显强。
2.5 大豆肽溶液的抗氧化值
亚油酸缓冲液与大豆肽混合溶液经抗氧化实验后，用分光光度计在481nm下测吸光值，再计算大豆肽溶液的相对过氧化值，以相对过氧化值的大小来表示大豆肽的抗氧化能力，结果见图3。
表2 不同蛋白酶水解产物大豆肽溶液的吸光值
吸光值
1（1h） 2（2h） 3（3h） 4（4h）
碱性酶 0.605 0.705 0.975 0.985
风味酶 0.545 0.632 0.877 0.909
复合酶 0.487 0.532 0.587 0.627
木瓜酶 0.340 0.349 0.355 0.412
菠萝酶 0.422 0.474 0.708 0.808
胃酶 0.231 0.243 0.293 0.299
胰酶 0.462 0.583 0.599 0.603

由图3可知，蛋白酶所水解的大豆肽溶液的抗氧化力随酶解时间（4h内）的延长，开始增加较快，后来增加缓慢，有的甚至停止。这7种酶中，碱性蛋白酶所水解的大豆肽溶液抗氧化值最大。
3 结论
（1）大豆肽具有抗氧化性，不同的蛋白酶所制备的大豆肽其抗氧化能力也不相同。
（2）在所研究的7种蛋白酶中碱性蛋白酶的水解能力最强和其所制备的大豆肽抗氧化值最大，应为最佳酶选。◇

参考文献
［1］Chen H M，Muramoto K.Y，amauchi F， etal. Antioxidative properties of histidine containing peptides desinned from peptide frangments found in the digests of asoybean protein .J. Agric. Food. Chem，1998，46:49-53.
［2］张学忠.大豆肽加工技术原理与应用.北京：科学技术文献出版社，1999：181-200.
［3］陈美珍.大豆分离蛋自酶解物清除羟自由基用的研究.食品科学，2002，23（1）；43-47.
［4］何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术.北京：中国轻工业出版社.
［5］Adler-Nissen J. Enzymic hydrolysis of food proteins. Elsevier Applied Science Publishers. New York，1986：74-78.

*项目资助：河南省重点科技攻关计划项目（0523011700）。
作者简介：黄纪念（1971～ ），男，河南汝南人，博士，副研究员，研究方向为农产品精深加工与功能食品开发。