如何提高sgRNA的打靶效率

如何提高sgRNA的打靶效率

为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率，比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA （sgRNA）的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法：将针对AAVS1位点的2个sgRNA序列分别插入表达Cas9的质粒pSpCas9上，再将其构建为Cas9-sgRNA二合一的共质粒以及独立表达sgRNA和Cas9的双质粒系统；质粒转染293T细胞后，用T7E1酶切方法检测打靶效率。结果：不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切；Cas9-sgRNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。