最近做taqman探针的绝对定量PCR，扩增效率偏低(<90%)，每次换了新探针后扩增效率就可以

最近做taqman探针的绝对定量PCR，扩增效率偏低(<90%)，每次换了新探针后扩增效率就上去，第二次就不行了（-20°保存），考虑是探针问题，想是不是操作过程中，体系暴露在灯下时间过长导致探针降解，可是以前做时探针没这么敏感啊，另外，标本都是肝移植后的标本，浓度本就偏低，大多阴性，扩增效率不高和标本浓度低有关系吗？另外和重复性也有关系吗？求解！谢谢！

你换了新探针是说从新设计合成了探针还是重新开一管探针？
如果是重新开一管的话，那怎么能保证模板还是原来的模板？严格的对照试验是你只能换一个条件，既然换了探针，模板问题怎么解决？另外根据我们的经验，不可能探针降解之类的问题，经常出现的就是标本问题，标本浓度低，扩增效率肯定会降低，因为探针引物在反应体系中遇到模板的概率也降低了。

（转载，仅供参考） a) 针对双标记探针的引物和探针设计的规则 所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行blast和类似的分析，以确保特异性。 通用原则 1， 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。 2， 扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性 3， 保持gc含量在20％和80％之间，gc富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在sg分析中非特异信号。 4， 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是g（不能有4个连续的g） 5， 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。 b），探针设计指导 1，在设计引物之前设计探针 2，探针的tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查gc富含区。 3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’g会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在 4，选择c多于g的链作探针，g的含量多于c会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。 6， 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。 7， 检测探针的dna折叠和二级结构。 c), 引物设计指导 1，引物的tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。 2，引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的g和c。 3，将引物尽量接近于探针 d循环参数 当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。 e)怎么优化探针和引物的浓度 对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的ct值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。 引物浓度应该在50nm -900nm 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果 探针浓度应该在50－250nm范围内优化 前引物 后引物 50 300 900 50 50/50 300/50 900/50 300 50/300 300/300 900/300 900 50/900 300/900 900/900 探针的浓度应该从（50，100，250nm）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在rotor-gene上进行试验， 选择最小ct值和最高反应扩增的曲线做后续试验。 g) 进一步的提示 通常所用的探针和引物浓度分别为250nm 和900nm，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。 由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。 引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。 primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的g，所以我们将3’端的g去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。 f)定量数据的分析 分析定量数据主要有两种基本的方法 i)绝对定量 ii)相对定量 研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据 h) 绝对定量 绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的dna样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。 在rotro-gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，r值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用sybr-green分析两个基因的使用者。 ii)相对定量 相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较ct值法（⊿⊿ct） 这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（normalizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看⊿ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个ct值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿ct 将是一条水平线（斜率<0.01）。这以为着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）