如何用紫外分光光度计测DNA浓度

如何用紫外分光光度计测DNA浓度

首先，分光光度计测量的样品必须是均一的，摇匀后再测量结果会准确些。它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如:1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等:在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
分光光度计的重要配件-- 比色杯
比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料(如考马斯亮兰)能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。
由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。
当然， 随着科技的发展，现在比色杯已经不是使用分光光度计时的必备物品。目前国外Nanodrop公司(现已被Thermo Fisher公司收购)生产的ND1000分光光度计与旧式分光光度计相比，已经可以做到无需稀释样品，无需使用比色杯，每次测量仅需1-2μl样品即可完成测量