初二下学期苏教课后问题.转基因抗虫烟草培育过程

应用农杆菌介导法的烟草转基因实验
一、实验目的
烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系.本实验以烟草为实验材料,使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤,掌握遗传转化的基本操作技术.
二、实验用具及药品
烟草叶片,LBA4404质粒载体,摇床,培养皿(带滤纸),移液枪,镊子,手术刀,无菌水
三、实验方法
根癌农杆菌介导转化的方法已经比较成熟,易于在植物细胞和组织培养实验室进行.具体操作程序如下：
(1)根癌农杆菌质粒的保存：构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上,YEP固体培养基的成分为每100mL含NaCl 0.5g,酵母1 g,水解酪蛋白1g,琼脂1.5g,pH值7.0,在冰箱中冷藏,一个月换一次培养基,保证菌种正常生长.
(2)配制YEP液体培养基：成分同上,只是不添加琼脂,分装于试管中,每试管加入5mL左右的液体培养基,包好后高压灭菌,放置于冰箱中待用.
(3)摇菌：用灭菌后的牙签或者火柴棍等挑出一些菌液,一起放入上述YEP液体培养基中,然后置于振荡器上摇菌16—17h(180r／min),直至溶液变浑浊,即有大量菌丝长出.
(4)用消毒后的0.5mm打孔器从叶片上切出叶盘,然后将叶盘投入农杆菌悬液中培养5min
(5)用滤纸吸干多余的菌液,叶片放在MS+6-BA 1.0 mg/L十IAA 0.1 mg/L培养基上共培养2d,随后转至附加卡那霉素100mg/L,羧苄青霉素500 mg/L的培养基上筛选培养,(25±1)℃,16h光周期.
(6)2周后分化出卡那霉素抗性芽（应为绿色）,从基部将芽切下,转至含100mg/L卡那霉素和500 mg/L羧苄青霉素的MS+0.1 mg/LIAA上生根培养,生根后的植株移入温室内栽培.
四、预期结果
愈伤组织：一周后在脱分化培养基上长出淡黄色、松散的愈伤组织.
幼芽：愈伤组织转入分化培养基两周后分化出卡那霉素抗性芽.
生根：芽转入生根培养基后可以生根.
五、作业要求
诱导出烟草愈伤组织并能够再生植株.每小组交出两三株再生并生根的烟草转基因植株.