real-time PCR复孔间的重复性差怎么办

real-time PCR复孔间的重复性差怎么办

学习做Realtime PCR, 实验结果是出来了,得到的内参、目的基因的Ct 值在15-25 之间,熔 融曲线基本上也是单峰,但不太会处理这个结果,对着数据发愁.不同的处理方法得到不 同的结果. 做的是相对定量,SYBR Green, 选用2^（-△ △ Ct）法 内参基因：对照。

real-time pcr中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量pcr技术。该技术借助于荧光信号来检测pcr产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到pcr每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定ct值，从而根据ct值确定起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量，较以往常用的终点定量的方法更加准确。根据所使用的技术不同，荧光定量pcr又可以分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方法。real-time pcr所采用的专用pcr仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。 rt-pcr是reverse transcription pcr的简称，中文译作“逆转录聚合酶链反应”，是将rna的反转录（rt）和cdna的聚合酶链式扩增（pcr）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从rna合成 cdna，再以cdna为模板，扩增合成目的片段。rt-pcr技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中rna病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna序列。作为模板的rna可以是总rna、mrna或体外转录的rna产物。无论使用何种rna，关键是确保rna中无rna酶和基因组dna的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、oligo dt及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mrna，三种都可。 real time rt-pcr是将real time-pcr的方法用于rt-pcr中，目的也是为了对样品浓度进行精确控制。 rt-pcr和real time-pcr是没有必然联系的，两种技术可以一起使用，就是real time rt-pcr；也可以单独使用。就是名称有点绕，逆转录pcr先出现，所以占用了rt-pcr这个简写，等real time-pcr技术出现后，本来按照惯例，简写也是rt-pcr，但为了与逆转录pcr相区别，还是写成real time-pcr。