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如何优化PCR反应体系

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解决时间 2021-02-06 06:58
如何优化PCR反应体系
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PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种,即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1、引物 引物是PCR特异性反应的关键。每条引物10~100pmol,浓度过高会引起错配和非特异性扩增,且可导致引物二聚体的形成。理论上,任何一段模板DNA序列,都能设计互补的寡核苷酸链做引物进行PCR扩增。设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:15~30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度:以200~500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40~60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物的特异性:应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
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