如何优化PCR反应体系

如何优化PCR反应体系

PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1、引物 引物是PCR特异性反应的关键。每条引物10～100pmol，浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可导致引物二聚体的形成。理论上，任何一段模板DNA序列，都能设计互补的寡核苷酸链做引物进行PCR扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15～30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物的特异性：应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。