微生物室被蜡样芽胞杆菌污染了怎么灭菌

微生物室被蜡样芽胞杆菌污染了怎么灭菌

蜡样芽孢杆菌是需氧性、有运动性、能产生芽孢的革兰氏阳性大杆菌。蜡样芽孢杆菌常在下列产品中存在，如乳、肉、蔬菜、甜点心、调味汁、凉拌菜、炒饭等。往往因不加热或加热不完全引起食物中毒。针对我公司对日出口高温杀菌产品中出现的腐败现象，经反复检测、试验，确定引起产品腐败变质的微生物为蜡样芽孢杆菌。本试验的目的为检测高温杀菌产品蜡样芽孢杆菌的污染现状与控制措施。

1 材料方法

1.1 设备和材料

吸管、培养箱、均质器、天平、菌落计数器、冰箱、微波炉、平皿、滤器、抽滤设备、无齿镊子。

1.2 培养基及试剂

NGKG寒天基础培地、NaCl、95％酒精、鸡蛋。

2 检测方法［1，2］

2.1 水中蜡样芽孢杆菌的检测方法

2.1.1 原理

用孔径为0.45mm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上培养，计数滤膜上的典型蜡样芽孢杆菌菌落总数。

2.1.2 检验步骤

过滤水样：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将1000ml水样（如水样含菌数较多可减少过滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门在-50kPa下抽滤。

培养：水样滤完后抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分移放在表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入恒温箱内，35℃培养48h。

结果观察：菌落特征为：35℃培养18h后，观察菌落，形成直径3～5mm，有的约10mm大而扁平、灰白色、粗糙的菌落。菌落表面粗糙似有毛玻璃状或溶蜡状，边缘呈扩展状。另外，在菌落周围因卵磷脂作用而形成明显的白至淡粉色的沉淀环。根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱不形成沉淀环的。即典型菌落应符合蜡样芽孢杆菌特征：中心菌落呈白色不规则状，即一般不呈光滑的圆形，不呈典型凸起状，而是扁平凸起；白色菌落外是淡粉色环；必须有卵黄反应（在集落周围形成因卵黄作用形成的明显的浑浊圈，根据菌株不同，也有卵黄反应稍弱，形成浅浑浊环的东西）。

计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数。

2.2 产品和环境中蜡样芽孢杆菌的检测方法

2.2.1 原理

蜡样芽孢杆菌呈卵磷脂酶阳性，在卵黄培养基上形成菌落周围明显的沉淀环。另，本菌在多粘菌素B中呈自然耐性，利用这些特性，使用作为选择分离培养基的加卵黄的NGKG寒天培地。

2.2.2 实验操作

样品制备：以无菌操作称取25g样品于灭菌均质杯内，加入225ml灭菌0.85％盐水，均质拍打30s，制成1∶10的样品匀液。预想到菌落会多的情况，进行梯度稀释。

分离接种：用无菌吸管分别吸取各梯度稀释液0.1ml分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上。

培养：迅速以L行玻璃棒将接种物涂布于培地表面，避免涂到平板边缘，将平板正置，直至接种物被培养基吸收，将平板翻转，35℃培养48h。

菌落观察：同上。

计数方法：在规定的培养时间内，取出平板观察，计数直径3～5mm，有时10mm的大扁平、灰白色、粗糙的集落。若吸取各梯度稀释液0.1m1分注到2个表面干燥的加卵黄的NGKG寒天培地上，则每g (ml)食品中蜡样芽孢杆菌的总数=2个平板上的菌落数的算术平均值×相应的稀释倍数×10。

例：将检样10**-1稀释液各0.1ml涂布于2个NGKG寒天培地平板上，各生长蜡样芽孢菌20个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为：

[(20+20)／2]×10×10**1=2.0×103个／g

2.3 污染的检测

2.3.1 产品中蜡样芽孢杆菌的检测方法（如上）

2.3.2 水中蜡样芽孢杆菌的检测方法为滤膜法[1] 使用测余氯的方法为比色法[2]。目的是研究自来水中的游离余氯对蜡样芽孢杆菌的影响。

2.4 杀灭研究

蜡样芽孢杆菌耐热，其37℃16h的肉汤培养物的D80值为10~15min；使肉汤中细菌(2.4×107/ml )转为阴性需100℃20min。其游离芽胞能耐受100℃30min，而干热灭菌需120℃60min才能杀死。蜡样芽胞杆菌在4℃、pH4.3、盐浓度18％的条件下仍能存活或生长。通过高温杀菌或适当的冷藏可以控制蜡样芽胞杆菌的增殖。且蜡样芽孢杆菌喜农作物，一般以芽孢的形式存在于食品中，在