怎么测一个基因是不是nf-kb的下游基因

怎么测一个基因是不是nf-kb的下游基因

有几种方法可以选择：
1.EMSA：一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。
2.western blot： 这个抗体应该用磷酸化的P65抗体，，因为只有磷酸化的蛋白才具有活性，你要是有钱的话，可以连总蛋白和磷酸化蛋白一起做，比较完善。
3.免疫组化： 也是可以的，原理跟western blot差不多。
4.双荧光素酶：还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。
总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。

nf-kappab是一个大家族，包括：rela(p65)、c-rel、relb、nf-kappab1 (p50/p105)、nf-kappab2 (p52/p100)。其中以rela(p65)研究最为深入。 通常所说的是左边的经典途径，大致意思是这样：非激活状态下，rela(p65)与一种名为ikappab的蛋白结合，停留在胞浆中，不发挥转录活性。当炎症因子等刺激时，ikappab的上游激酶ikappab kinase（ikk）磷酸化而激活。ikk使ikappab降解。p50有核定位信号，没有了ikappab的束缚，p50会拽着rela(p65)往核里面跑。rela(p65)识别特定的dna序列，并结合上去，从而调控靶基因的转录（这些基因的启动子上含有rela(p65)的结合序列：5’-ggg(a/g)(c/a/t)t(c/t)-3’）。 一般来说，nf-kappab的激活促进细胞生长，许多抗肿瘤药物以nf-kappab为靶点，有兴趣的战友可以找些相关文献来看看。然而，某些情况下nf-kappab的激活却有诱导凋亡的作用。 在读这篇文章以前，我一直认为nf-kappab的激活包括这样三个过程： （1）nf-kappab入核。 这个过程可以用western blot检测核蛋白中nf-kappab的水平，或者免疫荧光看nf-kappab的亚细胞定位。 （2）nf-kappab结合到dna上。 这个过程可以用emsa或chip来检测nf-kappab与dna的结合能力。 （3）启动某个基因的转录。 这个过程可以用荧光素酶报告基因技术检测靶基因的转录水平。 具体的实验原理和方法请大家自己去查，这里就不多说了 相信很多人都有跟我相同的观点，认为nf-kappab对靶基因的调控一定是促进的，从入核到结合到dna上，再到促进靶基因转录，顺理成章，所以在检测nf-kappab的激活的时候，就在上述三个环节选一个做做了事。最近帮老板评毕业论文，很多做nf-kappab的激活都只做了western blot检测核蛋白中nf-kappab的水平，或只做了荧光素酶。读了这篇文章以后，大家就会明白，仅仅做western或荧光素酶是不够的。 对于nf-kappab既有促生长又有促凋亡的作用，普遍的观点认为是nf-kappab选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子而导致的。然而在读了这篇文章后，我才知道原来nf-kappab对靶基因的调控不仅是促进的，还可以是抑制的。而nf-kappab既有促生长又有促凋亡的作用，不仅是由于nf-kappab选择性地结合促生长基因或促凋亡基因启动子，还可以是对靶基因的选择性地激活或抑制。至于如何选择，关键在于刺激因素。