定点突变的单点突变

定点突变的单点突变

对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质粒的定点突变的，通过优化试剂特别是其感受态细胞（XL10-Gold），使得较大的质粒的定点突变也一样简单。QuikChange由于操作简单快速，效率高（ >80%）而受到普遍欢迎，光是2012年的前9个月就有超过400篇发表的论文中用到这个产品。
定点突变的比较有特色的产品还有Clontech公司的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物（同一方向，对同一单链模版），一条包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点，不过在单酶切位点中引入突变，这样两条引物除了所包含的突变位点，其他序列和质粒上对应位置的序列完全一致，退火后和质粒模版结合，通过T4 DNA聚合酶延伸，延伸反应持续直到碰到另一条引物停止，两段包含突变位点的延伸产物经T4连接成环，和模版链组成杂和环，带有两处错配。单酶切反应产物，直接转化Ecoli BMH 71-18 mutS(错配修复缺陷株)。原来的双链质粒模版被切开而不能转化，而杂和质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，保持环状质粒得以转化。转化子的杂和双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，最后得到纯和的突变质粒。这个试剂盒则是利用改造单酶切位点使得新合成的突变质粒不被切开从而除去原来的模版质粒。虽然这个试剂盒比上一个麻烦，但实际上是引入了两个定点突变。只不过一个用于酶切除掉模版的反应。