如何构建RNA干扰载体

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解决时间 2021-03-14 14:42

提问者网友：欺烟
2021-03-13 19:20

如何构建RNA干扰载体

最佳答案

五星知识达人网友：怀裏藏嬌
2021-03-13 20:38

在RNA干扰实验中
首先需要构建dsRNA表达载体
将这种载体导入受体细胞中后
表达产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA
引起具有相同序列的mRNA发生讲解
导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质
所以个体会表现出功能缺失表型

构建表达载体通常选用dsRNA
需要注意的一些方面是
dsRNA序列中GC的含量要小于50%
高GC含量会降低RNAi的效果
选定的dsRNA序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性
以避免对其他同源性基因表达的抑制
不同区域的dsRNA具有不同的基因沉默效果
可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体
还要充分考虑siRNA的结构特征
siRNA与mRNA的同源程度对RNAi有明显影响
启动子区或者编码区与siRNA同源的基因受siRNA抑制
但siRNA在动物细胞中对mRNA的前体没有影响
所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi
而且在构建表达载体时
经常使用U6启动子等RNA聚合酶Ⅲ能够识别的启动子序列
最后将其转入到质粒中
这里说的只是一个简单的过程
总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程
如果要知道详细的技术
建议还是去看书吧
这里是说不清的

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1楼网友：琴狂剑也妄
2021-03-13 21:14

在rna干扰实验中首先需要构建dsrna表达载体将这种载体导入受体细胞中后表达产生的dsrna在dicer酶作用下形成sirna 引起具有相同序列的mrna发生讲解导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质所以个体会表现出功能缺失表型构建表达载体通常选用dsrna 需要注意的一些方面是 dsrna序列中gc的含量要小于50% 高gc含量会降低rnai的效果选定的dsrna序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性以避免对其他同源性基因表达的抑制不同区域的dsrna具有不同的基因沉默效果可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsrna表达载体还要充分考虑sirna的结构特征 sirna与mrna的同源程度对rnai有明显影响启动子区或者编码区与sirna同源的基因受sirna抑制但sirna在动物细胞中对mrna的前体没有影响所以含非编码区序列的dsrna不会引起rnai 而且在构建表达载体时经常使用u6启动子等rna聚合酶ⅲ能够识别的启动子序列最后将其转入到质粒中这里说的只是一个简单的过程总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程如果要知道详细的技术建议还是去看书吧这里是说不清的推荐一本书<rnai——基因沉默指南(生物实验室系列)> 上面什么都有正反义表达载体就是把目的基因正向或者反向插入到质粒中再转染质粒中含有正向插入目的基因的就是正义表达载体含有反向插入的就是反义表达载体

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