为什么QPCR引物设计在跨外显子的接头区

为什么QPCR引物设计在跨外显子的接头区

如果反转录体系里面有基因组残留，而且你的引物没有跨内含子，这样的情况下就很容易造成你的Ct偏小（除了cDNA扩增外，基因组的模板也会作为模板进行扩增，导致模板起始量偏高）；cDNA逆转后是切除内含子的，而基因组是存在内含子的，如果你的引物设计在了跨两个外显子的区域，则只能扩增cDNA而不扩增基因组。
引物不跨外显子设计也可以，但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因组，你实验的时候可以做一个NRT的对照看一下有没有基因组污染。我做好几个基因的引物就没有跨外显子设计，用的是R223 HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA Wiper)，每次NRT也没有扩增，去除基因组效果不错。