pcr退火温度太高有什么缺点

pcr退火温度太高有什么缺点

说影响得看情况，退火温度太高肯定会影响引物的结合效率的。但是，实际上，好的引物一般是上下游引物的退火温度比较接近。有时候，我们可能会通过牺牲特异性的手段（当GC含量过高时，减少引物长度）来平衡两条引物的退火温度。

高的退火温度是不利于复性的，所以不会因为使模板复性而降低扩增效率，倒是可能因为影响引物结合而降低扩增效率。不过65度应该没什么问题。我还是觉得两条引物退火温度一致最重要！

应该不会。我做的一个PCR反应的引物的长度为70nt。退火温度为68.9。PCR的结果任然很好。我使用的是pfu酶。
引物和模板的结合要比模板的正负链的复性要容易的多。这时要控制复性的时间。我所用的时间是1min。

65-70℃没问题。只要产物正确，可以再扩增。

在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合
但是如果到70℃的话都快到延伸的温度了，这也可能导致非特异的扩增。