PCR引物设计应该注意的问题?

设计引物应遵循以下原则：
　　①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右.
　　②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段.
　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列.
　　④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带.
　　⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败.
　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处.
　　⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.引物量：每条引物的浓度0.1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会.