用260/280检测核酸纯度到底准不准确

用260/280检测核酸纯度到底准不准确

首先

Warburg和Christian（1942）提出OD260/OD280比值是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指标。当蛋白中掺入了核酸之后，OD260/OD280比值变化很明显，尤其是纯的蛋白制品中掺入了一点点核酸后，变化最明显。例如：纯的蛋白样品，其OD260/OD280比值为0.57，而掺入5%的核酸之后，该笔直上升到了1.06。

但是反过来却是不成立的，即：这个比值不能用来指示核酸被蛋白污染的程度。因为核酸在260nm和280nm处的消光系数比蛋白质高很多，即使有明显的蛋白污染也不会大幅度改变核酸溶液的OD260：OD280比值。例如，纯的核酸的OD260：OD280比值是2.0，当掺入了5%的蛋白质污染之后，OD260：OD280比值变成1.99，掺入20%的蛋白质污染后，也才变成1.96。这就说明这个比值用来指示核酸被蛋白污染的程度是非常不灵敏的。

从下面这个表中就可以明显看出来。

蛋白质／ 核酸／ OD260:OD280

100 0 0.57

95 5 1.06

90 10 1.32

85 15 1.48

80 20 1.59

75 25 1.67

70 30 1.73

65 35 1.78

60 40 1.81

55 45 1.84

50 50 1.87

45 55 1.89

40 60 1.91

35 65 1.93

30 70 1.94

25 75 1.95

20 80 1.96

15 85 1.97

10 90 1.98

5 95 1.99

0 100 2

说得再明白一些，这个比值更适合衡量蛋白质中核酸的污染度的。

其次

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，但一定要注意：以上三者的吸收最高峰并不都在280nm处，其分别为257nm，275nm和280nm。当蛋白中的色氨酸含量偏高或偏低时，就一定会对260nm处的核酸吸收峰造成很大的影响。

第三

通常，使用 A260/A280 判断核酸的纯度。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。以RNA为例，首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/A280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在你的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。

目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2 左右，A260/A230 = 2 左右，A260/A215 = 1 左右。如果没有扫描数据，除了测定 A260/A280 比值外，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。另外，要考虑设备的线形范围 (如 A260 要处于 0.1 - 0.5 之间)，超出线形范围的读数没有太大参考价值的。另外有两个有趣的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。这两点也是要注意的，所以当我们用DEPC处理过的水溶解RNA并测定其260/280比值的时候，往往都是小于2.0的。

严格来讲并不精准，测不出绝对纯度。
260/280实际上是测核酸与蛋白质之比，但是DNA和RNA都有260吸光值，所以并不能区分核酸。

对于分子克隆实验而言，杂蛋白含量自然是越少越好，所以这个方法也是广泛使用的。