PCR产物直接测序的原理

PCR产物直接测序的原理

原理：
是来至于双脱氧链终止法——现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出：
模板经过测序PCR反应后形成3'末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差一个碱基的不同长度的产物，再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列。

以上——手打——希望对你有帮助

优点：
一是操作易于标准化与自动化，因为它是一个单一的酶的反应过程，不依赖于生物体；
二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序，而PCR产物克隆后测序时，样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定。因为只有这样，才能区别突变是基因组本来就有的，还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的。

pcr在扩增的过程中可能会出现突变的情况，测序结果中就可能会出现套峰之类的情况，而克隆之后测序理论上每个单克隆里面只会出现一种pcr产物的插入片段，可以挑选不同的克隆进行测序，直到找到自己想要的那个。

目前常用的方法是连到T载体上这样可以用通用引物。如果直接测序的话（最少得纯化一下，脱盐等），可以用你自己的引物（做PCR时用的）。

PCR产物测序原理也是基于双脱氧核糖核苷终止法。只不过测序用的引物就是你自己做PCR时的引物。用PCR产物直接测序缺陷是两端靠近引物的序列容易测不准，因此想获得PCR产物全序列测序的话还是要链接到载体上测序为好。