如何获得高纯度植物基因组DNA

如何获得高纯度植物基因组DNA

传统的DNA 提取与纯化,如
CTAB 法、SDS 法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有
机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水
相,达到分离核酸的目的;加入RNA 酶除去核酸中的RNA;
然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70 %乙醇漂洗沉淀,除
去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解
和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE 溶解DNA 备用。
CTAB 是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物
在高盐( > 0. 7 mol/ L) 浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓
度(0. 1～0. 5 mol/ L NaCl) 下CTAB - 核酸复合物就因溶解度
降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇
沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CTAB - 核酸复
合物再用70 %酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。SDS 是一种阴离子
去垢剂,在高温(55～65 ℃) 条件下能裂解细胞,使染色体离
析、蛋白变性,同时SDS 与蛋白质和多糖结合成复合物,释放
出核酸;提高盐(KAc 或NH4Ac) 浓度并降低温度(冰浴) ,使
SDS - 蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白
质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的
DNA 用酚/ 氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
SDS 法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA ,但所得
到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA 经典的提取方法由
于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA 纯度能够满足一般分
子生物学的需要,一直作为DNA 提取的常规方法。但这种
方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA 溶液
中有机物质对DNA 聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有
机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的
应用受到一定的局限性。