流式荧光补偿调节不对的话会怎么样

流式荧光补偿调节不对的话会怎么样

流式细胞术中荧光补偿该如何调节？

以FITC和PE为例来看光谱重叠。FITC单染管的荧光会部分漏到PE通道中，而这部分需要从PE通道中减掉溢漏过来的FITC荧光。
那么荧光补偿该如何调节呢？
l 调节电压
l 检测荧光通道的自发荧光
l 每个荧光通道做单染管对照检测
何为单染管对照？
l 细胞
l 补偿微球
细胞通常是流式抗体单染管对照的样本首选，但是当细胞数量有限，无多余细胞用于抗体单染或感兴趣的表面抗原表达较低，阳性分群不明显不足以用来调节补偿时，建议选择补偿微球。
补偿调节时要注意：
l 使用未染色的细胞做PMT的电压设置
l 不要使用未染色的补偿微球设置电压
eBioscience提供两种补偿微球：OneComp eBeads与UltraComp eBeads。
微球大小和淋巴细胞相当，可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。每滴微球中都含有两群：一群是可以结合抗体的阳性群，一群是不会与抗体反应的阴性群。
优点：
l 使用方便，一滴即可
l 使用实验抗体与微球有效结合调节补偿，无需再用CD4分群来调节
l 细胞替代物，适应各种孵育时间，结果稳定
流式细胞术中荧光补偿该如何调节？
l 能与各种种属和亚型的抗体反应
Product
Species Compatibility
Chain Recognition
Features
Mouse Ig
Rat Ig
Hamster Ig
Rabbit Ig
Kappa Light Chain
Lambda Light Chain
One Drop
One Vial
All cell sizes
Violet Laser
UltraComp eBeads 01-2222
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OneComp eBeads 01-1111
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Competitor X Anti-Mouse Ig, k
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Competitor X Anti-Rat Ig, k
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Competitor X Anti-Rat/Hamster Ig, k
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Competitor X Plus Anti-Mouse Ig, k
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Competitor X Plus Anti-Rat Ig, k
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Competitor Z Anti-Mouse Bead Kit
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竞争品牌的微球是分种属的，使用不同抗体要购买多个产品以使用
注：兔来源的抗体与微球结合力较弱，但某些还是可以使用
l 适用于各种激发光---适用于488 nm 蓝光，532 nm 绿光，561 nm 黄光，633-635 nm 红光，UltraComp eBeads尤其适用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器
l 微球本身信号经过优化适合补偿调节
l 价格相当，有小包装
操作步骤：
1. 准备好流式管，每种荧光抗体一个；
2. 将微球翻转或者涡旋混匀；
3. 在每管中加入一滴微球；
4. 在管中分别加入相应的 1 test 抗体（不同抗体 1 test 的用量不同，具体参见说明书）；
5. 敲击或者涡旋混匀；
6. 2-8℃暗处孵育 15-30 分钟；
7. 每管加 2ml 流式染色缓冲液，400-600 x g 离心 3-5 分钟；
8. 弃上清，每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色缓冲液；
9. 混匀后上机分析