如何从发酵工艺改进的角度，进一步提高透明质酸产量

如何从发酵工艺改进的角度，进一步提高透明质酸产量

菌种分离筛选操作方法
(1) 初筛。将牛鼻黏膜用0. 1 %蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在37 ℃下培养24 h 。观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏染色 并镜检。
(2) 复筛。在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株,每株3 瓶,在200 r/ min , 37 ℃下培养24 h 。用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。
(3) 红外吸收光谱法。取HA 2 mg , KBr 压片,用IR2400 红外分光光度计在4000 ～ 500cm- 1 范围内扫描。 2. 2.3 诱变方法
人们研究发现， 链球菌属和多种细菌都有荚膜， 这种荚膜的主要成分是HA， 同时， 在这些细菌中也含有透明质酸酶， 它使HA降解， 所以，发酵法生产HA的基础是找到高产HA， 又不产生透明质酸酶的菌种。
(1) 制备菌液。菌液经3500 r/ min 离心10min 后弃上清。供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2 次,重新悬浮于5 mL 生理盐水中,摇匀后倒入盛有45 mL 灭菌生理盐水并带玻璃珠的100 mL 锥形瓶中,振荡10 min , 调整细胞浓度至108 / mL 。在进行诱变处理菌体时,用0. 1mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸盐缓冲液代替生理盐水,其他与供紫外线诱变处理菌体的菌液制备相同。
(2) 紫外线诱变处理。紫外灯的功率为15W ,照射距离为30 cm。将3 mL 菌液和磁力搅拌棒放入直径为9 cm 的无菌培养皿中,搅拌照射时间为2 min 。
(3) N TG 诱变处理。称取1 mg N TG 倒入无菌离心管中,加入0. 1 mol/ L 、p H = 6. 0 的磷酸缓冲液1 mL ,暗处振荡溶解。取4 mL 菌液加入上述离心管中,充分摇匀,立即置于37 ℃水浴振荡处理30 min (N TG 处理终浓度为100 g/mL) 后,离心收集菌体,将含N TG 的上清液倒入浓NaO H 溶液弃去,用无菌水洗涤菌体3 次,用大量稀释法终止N TG 的诱变,最后向离心管中加5 mL 无菌生理盐水。