做点突变pcr后不用dpn i酶切可以吗

做点突变pcr后不用dpn i酶切可以吗

定点突变是先把突变位点设计在引物上（通常是接近引物中央），正反引物最好互补，然后通过普通PCR扩增前后两个片段，胶回收。将两个片段的回收产物混合，用重叠PCR扩增得到全长。这样就通过在中间引物上设计突变的方式达到定点突变。对于单点突变，Stratagene公司的QuikChangeSite—DirectedMutagenesisKit是不错的选择。通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规大肠杆菌中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物(正、反向)和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝)。正、反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎(Dpn I识别序列为甲基化的GATC，GATC在/L乎各种质粒中都会出现，而且不止一次)，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙地利用甲基化的模板质粒对Dpn I敏感，而合成的突变质粒对Dpn I酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外，由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene公司的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过8kb的质粒。